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PLOS ONE:我科学家用CRISPR制备基因敲入猪
文/admin      2016/01/15
  在1月12日,来自中科院广州生物医药与健康研究院、吉林大学和云南农业大学的研究人员,在国际著名的综合性学术刊物《PLoS ONE》发表的一项研究中,通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑,制备了携带Oct4-tdTomato报告基因的基因敲入猪。
 
  目前为止,科学家一直未能制备出可产生种系嵌合体的猪多能干细胞。基于Oct4启动子的荧光报告系统,可被用于监控多能性,是制备真正的猪多能干细胞的重要工具。1月12日,来自中科院广州生物医药与健康研究院、吉林大学和云南农业大学的研究人员,在国际著名的综合性学术刊物《PLOS ONE》发表题为“Generation of Knock-In Pigs Carrying Oct4-tdTomato Reporter through CRISPR/Cas9-Mediated Genome Engineering”的学术成果。在这项研究中,研究人员通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑,制备了携带Oct4-tdTomato报告基因的基因敲入猪。中科院广州生物医药与健康研究院的赖良学、Qingjian Zou和云南农业大学的曾养志教授是本文共同通讯作者。延伸阅读:我学者用CRISPR让猪生产人血白蛋白。
 
  转基因猪在农业和生物医药方面都有着广泛的应用。然而,生殖系有活性的猪多能干细胞(PSCs)目前尚未制备出来,这阻碍了猪模型的遗传修饰。为了解决这个问题,一种可能的解决办法是,为猪PSCs生成一种荧光报告系统。
 
  转录因子Oct4,又名POU5F1,可维持细胞的多能性,因此,它的表达反映了干细胞多能性。猪的Oct4报告系统之前已有过报道。然而,关于“猪Oct4启动子的基因组结构”的知识还是有限的;因此,小鼠Oct4启动子被用来控制EGFP的表达,猪Oct4基因起始密码子上游(4000 bp)也被用来作为Oct4启动子。
 
  小鼠Oct4启动子与猪转录调节因子不能很好地相互作用,4000 bp组成型启动子可能并不包含所有的调控元件。在猪当中,我们可通过随机地将外源报告载体整合到猪基因组中,构建基于小鼠或猪Oct4启动子的荧光报告系统。组成型表达载体中Oct4启动子不完全的监控区域,以及这些载体的不确定的整合位点,可能会影响其调节功能的准确性。此外,拷贝数变化和内源性基因破坏的风险,可能会进一步影响报告基因的表达。将一个报告基因精确插入内源Oct4的框架,可允许内源性启动子诱导的报告基因表达,而不改变内源性Oct4的表达,从而可提高猪Oct4表达模拟的精度。
 
  将外源基因敲入猪体细胞的基因组中,一直都是极为困难的,因为传统的同源重组(HR)效率极低。最近发展起来的CRISPR/Cas9系统,可在合成的单导向RNA(sgRNA)的辅助下,用简单的碱基互补,靶定和编辑特定的基因组位点。该CRISPR/Cas9系统已用于编辑各种生物的基因组,包括原核生物和真核生物。序列特异性核酸酶能有效地在DNA中产生双链断裂,并通过同源指导修复显著增加HR的效率。
 
  在这项研究中,研究人员构建了一个猪Oct4的报告系统,其中内源性Oct4启动子可直接控制红色荧光蛋白(RFP)。通过同源重组(HR),研究人员将2A-tdTomato序列插入并替换猪Oct4基因的终止密码子。因此,荧光能准确地显示内源性Oct4的激活。利用CRISPR/Cas9系统,研究人员获得了在内源性Oct4基因启动子下游具有tdTomato基因敲入的猪胎儿成纤维细胞(PFF)系。转基因的PFFs可被用作体细胞核移植(SCNT)的供体细胞。
 
  研究人员在SCNT胎儿的囊胚和生殖嵴中,检测到了强大的RFP表达。通过SCNT,研究人员也制备了两只有生活力的转基因猪。通过另一轮SCNT对来自胎儿和仔猪的成纤维细胞进行重编程,可导致重构囊胚中的tdTomato再激活。结果表明,监测细胞多能性状态的一个KI猪报告系统,已被成功构建。
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